根據(jù)起終點設(shè)置需要，11月15日20:00開始至比賽結(jié)束，江東中路（奧體大街至夢都大街段）雙向道路、奧體大街（江東中路至燕山路段）雙向道路、燕津大道（燕春路至嘉善路段）雙向道路實行臨時封閉，禁止車輛通行。
根據(jù)比賽進程，11月16日7:00開始至比賽結(jié)束，下列時間、道路除持2025南京馬拉松賽專用證件的車輛和人員外，車輛和行人按以下規(guī)定分時、分段禁止通行：
| 序號 | 封閉開始時間 | 封閉路段及方向 | 限制規(guī)定 |
| 01 | 7時10分起 | 夢都大街（江東中路至西城路段），雙向 | 禁止機動車輛通行（持2025南京馬拉松賽專用證件的車輛和人員除外） |
| 02 | 7時15分起 | 西城路（夢都大街至應(yīng)天大街段），雙向 | |
| 03 | 7時20分起 | 應(yīng)天大街（西城路至雨花路段），西向東方向地面道路 | |
| 04 | 7時25分起 | 1. 雨花路（應(yīng)天大街至中華門城堡段），雙向；2. 中華路（中華門城堡至白下路段），雙向 | |
| 05 | 7時30分起 | 1. 白下路（中華路至中山南路段），雙向；2. 中山南路（白下路至中山東路段），雙向 | |
| 06 | 7時35分起 | 1. 中山路（中山南路至長江路段），雙向；2. 長江路（中山路至漢府街段），雙向 | |
| 07 | 7時45分起 | 1. 漢府街（長江路至龍蟠中路段），雙向；2. 龍蟠中路（漢府街至珠江路段），北向南方向；3. 龍蟠中路（珠江路至北京東路段），南向北方向 | |
| 08 | 7時50分起 | 北京東路（龍蟠中路至太平門），西向東方向 | |
| 09 | 7時55分起 | 龍蟠路（太平門路至太陽宮段），北向南方向 | |
| 10 | 8時10分起 | 1. 神武路（玄武門至板井巷段），雙向；2. 板井巷（神武路至新模范馬路段），雙向；3. 中央路（板井巷至新模范馬路段），雙向 | |
| 11 | 8時15分起 | 模范馬路一線（中央路至淮濱路段），東向西方向地面道路 | |
| 12 | 8時30分起 | 淮濱路（模范西路至江邊南路段），雙向 | |
| 13 | 8時35分起 | 江邊路一線（南通路至寶塔橋西街段），雙向 | |
| 14 | 8時45分起 | 寶塔橋西街（江邊路至燕江路段），雙向 | |
| 15 | 8時50分起 | 燕江路（象山路至中央北路段），雙向 | |
| 16 | 8時55分起 | 永濟大道（中央北路至和燕路段），雙向 | |
| 17 | 9時15分起 | 燕津大道（和燕路至燕春路段），雙向 |
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